撰文：王有望 李承珉

作者為中科院生物物理所朱平組在讀研究生。

一門偉大的科學(xué)技術(shù)想要造福全人類，需要通過(guò)很多科學(xué)家的努力來(lái)提升性能，減少成本，同時(shí)降低門檻，最終能讓一個(gè)非專業(yè)訓(xùn)練的人能用較少的資源獲得高性價(jià)比的成果。作為《自然·方法》（Nature Methods）盤點(diǎn)的2015年最受關(guān)注的技術(shù)，冷凍電鏡（cryo-EM）三維重構(gòu)技術(shù)也不例外。冷凍電鏡方法早在1968年就開始發(fā)展，但是由于技術(shù)方法的瓶頸，一直只能做一些較低分辨率的結(jié)構(gòu)解析工作。近年來(lái)，冷凍電鏡技術(shù)飛速發(fā)展，不斷突破，在分辨率上已經(jīng)開始可以和晶體學(xué)相媲美。而且，由于其不需要結(jié)晶，對(duì)樣品的均一性要求也相對(duì)較低，樣品用量少，可重復(fù)性較高，加上快速冷凍能使生物分子盡量保持其天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)，冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域一顆亮眼的明星。

冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)革命性的突破主要來(lái)自兩個(gè)方面：一是直接電子探測(cè)器的發(fā)明，二是高分辨圖像處理算法的改進(jìn)。前者從硬件上讓電鏡的圖片質(zhì)量和信噪比有了質(zhì)的提升，將冷凍電鏡帶入了一個(gè)以電影的形式快速記錄電鏡圖像的新時(shí)代，后者則從軟件上將冷凍電鏡分辨率推入到了一個(gè)全新的高度，甚至讓高度柔性動(dòng)態(tài)的樣品的高分辨解析變得可能。

在直接電子探測(cè)器的幫助下，對(duì)于比較好的樣品，一般自動(dòng)收集1到2天的照片，就有可能獲得足夠解析到原子分辨率的優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)。然而接下來(lái)，對(duì)數(shù)據(jù)的分析與處理，可能要花費(fèi)一個(gè)專業(yè)人員數(shù)周以上的時(shí)間。對(duì)于一個(gè)包含數(shù)百萬(wàn)個(gè)顆粒，擁有多個(gè)構(gòu)像分子量較大的數(shù)據(jù)，即使在高性能計(jì)算集群上，也可能要花費(fèi)超過(guò)50萬(wàn) CPU小時(shí)的時(shí)間。引入 GPU 加速技術(shù)是目前很多主流軟件的選擇，譬如Relion GPU版，在GPU的加速幫助下，已經(jīng)大大縮短了分析計(jì)算的時(shí)間與成本。相對(duì)以前的軟件需要的較多的人工干預(yù)，Relion非常簡(jiǎn)潔，對(duì)電鏡新人非常的友好。事實(shí)上，相對(duì)簡(jiǎn)潔易用的Relion軟件及其采用的基于最大似然概率方法的三維分類技術(shù)正是冷凍電鏡革命性突破的重要推手之一。然而，即使是Relion的GPU版本，投入在分析計(jì)算的時(shí)間與資源，需要人工輸入以及調(diào)整的參數(shù)數(shù)量，以及對(duì)一個(gè)比較正確的初始模型的依賴，依然還有提升空間（圖1）。

圖 1：RELION-2.0的計(jì)算流程。對(duì)顆粒進(jìn)行快速傅里葉變換，與模型的傅里葉變換的每個(gè)取向（包括三維空間的3個(gè)旋轉(zhuǎn)參數(shù)和平面內(nèi)的2個(gè)平移參數(shù)）的切片進(jìn)行比對(duì)，得出取向分布函數(shù)，根據(jù)分布函數(shù)加權(quán)重構(gòu)出新的模型。

在2月6號(hào)在線發(fā)表的《自然·方法》上，來(lái)自多倫多大學(xué)和約克大學(xué)的研究小組介紹了他們新開發(fā)的一款名叫cryoSPARC的軟件，用于快速無(wú)監(jiān)督的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析（rapid unsupervised cryo-EM structure determination）。與Relion等目前主流電鏡軟件相比，cryoSPARC引入了兩個(gè)新的算法進(jìn)行改良。第一個(gè)是隨機(jī)梯度下降法（stochastic gradientdescent，簡(jiǎn)稱SGD），用于快速尋找低分辨率的三維模型，可以從電鏡數(shù)據(jù)上直接搭建初始模型。在冷凍電鏡三維重構(gòu)中，利用不同方法獲得一個(gè)相對(duì)比較正確的初始模型并輸入到Relion等軟件來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步三維分類和重構(gòu)是一個(gè)較為常規(guī)的手段。而cryoSPARC則很好地集成了這個(gè)問題，不再需要人為去“告訴”以及干預(yù)它使用什么樣的初始模型。這樣也能比較好地避免人為給予的模型帶來(lái)的模型偏向（model bias）。事實(shí)上，開發(fā)者們對(duì)于這個(gè)算法帶來(lái)的優(yōu)化非常自信，以至于他們將這套軟件命名為cryoSPARC ,即“cryo-EM single-particle ab initio reconstruction and classification”的縮寫，翻譯成中文就是冷凍電鏡單顆粒從頭重構(gòu)和分類技術(shù)。第二個(gè)算法則是分支界限最大似然優(yōu)化法（branch-and-bound maximum likelihood optimization），用于改進(jìn)顆粒對(duì)齊方式，減少冗余計(jì)算，從而節(jié)約大量計(jì)算資源以及加速高分辨率的重構(gòu)步驟。Relion在這一步使用的是傅里葉空間的全局搜索和局域搜索結(jié)合的方式，先進(jìn)行全局的暴力搜索，找到顆粒的比較正確的空間參數(shù)后再進(jìn)行局域搜索，直到收斂。這種方法比較耗費(fèi)時(shí)間，一直是Relion的限速步驟之一。分支界限法的引入和加速，使得原本復(fù)雜費(fèi)時(shí)的冷凍電鏡三維重構(gòu)工作，現(xiàn)在有可能在相對(duì)簡(jiǎn)單配置的臺(tái)式工作電腦上很快地完成。

這兩大算法，并非研究者們?cè)瓌?chuàng)。SGD算法在深度學(xué)習(xí)領(lǐng)域，尤其是圖像識(shí)別與語(yǔ)音識(shí)別領(lǐng)域，應(yīng)用十分廣泛。SGD是針對(duì)非凸優(yōu)化問題比較常用的算法。冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)正是一個(gè)典型的非凸優(yōu)化問題。它存在很多局域最優(yōu)解，如果初始條件給的不好或者稍微出現(xiàn)偏差，便很容易陷入局域最優(yōu)的狀態(tài)。這給高分辨結(jié)構(gòu)解析帶來(lái)了很大挑戰(zhàn)。SGD算法或許能帶來(lái)一個(gè)新的思路。就如同一個(gè)登山的游客想從山頂快速到達(dá)山腳，比較有效的一種方法就是他每到一個(gè)點(diǎn)都環(huán)顧四周，總可以找到某個(gè)方向是梯度最大的，也就是坡度最陡。就這樣，他總能找到一條路可以最快到達(dá)山腳。這便是經(jīng)典的梯度下降法。然而如果這個(gè)山山谷比較多（即非凸問題），他也很可能會(huì)因?yàn)檫@個(gè)方法陷入到某個(gè)山谷，而無(wú)法到達(dá)地面。隨機(jī)梯度下降則有可能會(huì)避免這個(gè)問題，他不會(huì)去測(cè)所有方向的梯度，而是每次隨機(jī)選擇某些方向，尋找梯度最小，到達(dá)新的位置后再隨機(jī)尋找新的方向，直至最后收斂。雖然迭代到最終收斂需要的次數(shù)會(huì)比傳統(tǒng)梯度下降法多，但是由于需要訓(xùn)練的數(shù)據(jù)少，可以大幅下降計(jì)算耗時(shí)，而且多次重復(fù)隨機(jī)，可以有效避免局域最優(yōu)問題。事實(shí)上對(duì)于非凸問題SGD算法也只能保證局域收斂，然而有意思的是，研究者們發(fā)現(xiàn)對(duì)于電鏡數(shù)據(jù)，這種算法會(huì)有非常好的表現(xiàn)。

分支界限算法算法是一種在解空間樹上搜索問題解的方法，使用廣度優(yōu)先或最小耗費(fèi)優(yōu)先的方法搜索空間樹。假如你現(xiàn)在需要從一堆數(shù)中挑選最小的那一個(gè)。你可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，例如Ａ和Ｂ。如果你能夠統(tǒng)計(jì)出Ａ組的下界大于Ｂ組的某個(gè)值，那么你就可以放心大膽的將Ａ組數(shù)據(jù)全部丟棄，然后對(duì)Ｂ組數(shù)據(jù)采用同樣的方法。和二分法有些相似。冷凍電鏡三維重構(gòu)中的三維精修過(guò)程中最消耗資源的步驟就是統(tǒng)計(jì)每個(gè)顆粒與三維模型的每個(gè)取向上的似然度，然后做出取向分布函數(shù)（也就是Expectation步驟）。顯然，如果對(duì)所有空間取向和所有傅里葉空間頻率進(jìn)行搜索是一個(gè)很巨量的計(jì)算任務(wù)，而且有可能會(huì)因?yàn)轭w粒信噪比較低的原因，顆粒信息量的分配會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。分支界限法的關(guān)鍵是如何分組并得到一個(gè)下界，這個(gè)下界要易于計(jì)算并且能夠保證排除掉的一定不會(huì)存在最優(yōu)解。研究人員給出的方法的假設(shè)是：如果一個(gè)顆粒在低分辨時(shí)就無(wú)法與低分辨模型很好的匹配，那么這個(gè)顆粒在高分辨時(shí)也是無(wú)法對(duì)齊的。所以第一輪全局搜索只統(tǒng)計(jì)低分辨信息，隨后的搜索都是在局域完成的。這樣，整個(gè)Expectation的步驟就可以很快完成，三維分類和三維精修就得到了加速。

為了測(cè)試這兩大算法能否真正有效，研究者們對(duì)已發(fā)表的數(shù)套數(shù)據(jù)進(jìn)行了測(cè)試，包括嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)的20S蛋白酶體，瘧原蟲（Plasmodium falciparum）的80S核糖體，以及amphipol-solubilized rat的TRPV1通道蛋白，以及嗜熱菌（T. thermophilus）的V/A-ATPase酶。測(cè)試工具僅僅是一臺(tái)配置了i7-5820K CPU處理器和一塊單獨(dú)英偉達(dá)特斯拉系列K40GPU顯卡的工作站。對(duì)于電鏡計(jì)算來(lái)說(shuō)，這已經(jīng)是非常簡(jiǎn)陋的配置了。然而就是在這樣的配置下，研究者們花費(fèi)幾十分鐘或數(shù)個(gè)小時(shí)，就可以完成整個(gè)重構(gòu)過(guò)程。而即使是Relion GPU版，完成相同任務(wù)也可能需要數(shù)倍甚至十倍的時(shí)間。圖二展示了他們測(cè)試使用的數(shù)據(jù)，每一步驟的時(shí)間以及最終到達(dá)的分辨率。雖然他們很好的節(jié)約了計(jì)算時(shí)間與資源，但是在計(jì)算的準(zhǔn)確性上，絲毫沒有降低，反而還能得到一些更好的結(jié)果。譬如對(duì)35645個(gè)TRPV1的顆粒數(shù)據(jù)耗時(shí)66分鐘最終重構(gòu)結(jié)果為3.3埃，略高于已發(fā)表的3.4埃結(jié)果。有意思的是，對(duì)于嗜熱菌的V/A-ATPase的數(shù)據(jù)，使用cryoSPARC分類重構(gòu)，最終得到三類狀態(tài)，分別為6.4埃，7.6埃以及7.9埃。而已發(fā)表的結(jié)果里，只得到了兩種狀態(tài)，分辨率分別6.4埃和9.5埃。看來(lái)這種自主建初始模型的行為，可能對(duì)于分類會(huì)有不錯(cuò)的幫助（圖2）。

圖2：使用SGD算法和分支界限法的計(jì)算流程與耗時(shí)(ref.1)

雖然從研究者們測(cè)試的數(shù)據(jù)來(lái)看，集合了隨機(jī)梯度下降法和分支界限法的cryoSPARC軟件有著性價(jià)比極高的處理能力，然而在制約冷凍電鏡三維重構(gòu)的一些關(guān)鍵性問題上，譬如顆粒的取向優(yōu)勢(shì)和低信噪比等問題，并沒有表現(xiàn)的比Relion更加優(yōu)異。不過(guò)這掩蓋不了它的強(qiáng)大，特別是如果該軟件以后能在使用者自己的數(shù)據(jù)上有如同測(cè)試數(shù)據(jù)一樣優(yōu)秀的表現(xiàn)的話。借鑒使用別的領(lǐng)域成熟而且優(yōu)秀的算法是大勢(shì)所趨，尤其在人工智能深度學(xué)習(xí)快速發(fā)展的今天。相信在不遠(yuǎn)的未來(lái)，隨著各領(lǐng)域的交叉融合，越來(lái)越多的不同領(lǐng)域的優(yōu)秀人員加入到電鏡技術(shù)的開發(fā)與研究，電鏡這門偉大的科學(xué)技術(shù)將為人類帶來(lái)更大的福利。

參考文獻(xiàn)：

1. Punjani A, Rubinstein JL, Fleet DJ & Brubaker MA. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.Nat Methods, 2017, doi:10.1038/nmeth.4169

2. Nogales E &Scheres SH. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.Mol Cell, 2015. 58(4):677-89

3. Kimanius D, Forsberg BO, Scheres SH,& Lindahl E. Accelerated cryo-EM structure determination with parallelisation using GPUs in RELION-2.Elife. 5: e18722. doi:10.7554/eLife.18722

4. EDITORIAL, Method of the Year 2015,Nat Methods, 2016, 13(1). doi:10.1038/nmeth.3730

5. Bottou L. Large-scale machine learning with stochastic gradient descent. InProc. COMPSTAT’2010 (eds. Lechevallier, Y. & Saporta, G.).177–186 (2010).

注：中國(guó)生物物理學(xué)會(huì)設(shè)有冷凍電鏡分會(huì)(全稱為“冷凍電子顯微學(xué)分會(huì)”, 原名為“生物超微結(jié)構(gòu)顯微成像專業(yè)委員會(huì)”)，主辦過(guò)多場(chǎng)冷凍電鏡方面的高端學(xué)術(shù)研討會(huì)，并打造了冷凍電鏡技術(shù)培訓(xùn)的系列精品課程。

2017年生物物理學(xué)會(huì)將繼續(xù)舉辦冷凍電鏡研討會(huì)及技術(shù)培訓(xùn)課程。有興趣者請(qǐng)關(guān)注生物物理學(xué)會(huì)官網(wǎng)或微信公號(hào) (ID: BPSC1979)。